"La microscopia a forza atomica"
Cesare Ascoli e Riccardo Gottardi

La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica nata una quindicina di anni fa. Si basa sulla misura delle deflessioni di una levetta microscopica dotata di una punta alla sua estremità (simile ad una levetta di grammofono rimpicciolita), e permette di ricostruire la topografia di una superficie "spazzata" dalla punta. E' possibile misurare deflessioni di frazioni di Angstrom, corrispondenti a forze dell'ordine dei piconewton. 
Nelle slides in allegato viene presentata dapprima una ricerca in corso su un preparato di interesse biologico (purple membrane di Halobcterium salinarum) che usa l'AFM come strumento di indagine. Questa presentazione ha lo scopo di mostrare alcune delle potenzialità concrete dello strumento. Viene quindi data una presentazione più generale del funzionamento e dei possibili utilizzi dell'AFM.

Studio della batteriorodopsina tramite AFM: prime misure

Viene data un'idea generale dello scopo della ricerca ed una presentazione schematica dell'AFM e dei suoi principi di funzionamento. 
I primi test sul funzionamento dell'AFM commerciale Molecular Imaging sono stati fatti scansionando della mica. Si è raggiunta la risoluzione atomica dei singoli atomi del reticolo della mica, sia in aria sia in acqua. 
Viene quindi descritto il setup dell'esperimento ed i risultati ottenuti che vengono poi confrontati con quelli disponibili in letteratura.Vi è un'eccellente risoluzione dei frammenti di purple membrane e si arriva poi alla risoluzione molecolare delle singole molecole di batteriorodopsina, che era l'obiettivo intermedio della ricerca (vedasi figura qui accanto).
Infine vengono presentati possibili sviluppi della ricerca quali: la combinazione di metodi differenti (AFM, cristallografia elettronica, cristallografia a raggi X) per ottenere uno schema preciso della struttura della molecola di batteriorodopsina, l'estrazione di proteine singole tramite aggancio alla punta dell'AFM per studiarne le caratteristiche elastiche, l'analisi delle variazioni conformazionali delle proteine dovute all'applicazione di una forza o all'eccitazione tramite fotoni.

Il funzionamento e gli utilizzi dell'AFM

Viene presentata la struttura dell'AFM ed il suo funzionamento. Punto chiave dello strumento è la punta che scansiona il campione di cui sono disponibili alcune foto. 
Viene mostrato un esempio tipico di risoluzione atomica elaborata in 3D della struttura cristallina della mica.
Cruciale è l'interazione della punta con il campione che è un'interazione del tipo Lennard-Jones. Viene descritto il diverso comportamento della punta mentre si avvicina al campione fino ad arrivare in contatto e mentre se ne allontana. Tale comportamento viene rappresentato dalle curve forza-distanza che danno informazioni non topografiche sul campione.
In aria ed in acqua i comportamenti sono differenti. In aria infatti, salvo casi estremi, si forma sempre un menisco tra la punta ed il campione e le forze di menisco modificano in maniera sostanziale la risposta della punta agli spostamenti di avvicinamento ed allontanamento dal campione. In acqua, chiaramente, non vi è formazione di menisco ed i risultati delle curve forza-distanza sono differenti. Le curve forza distanza sono influenzate dall'agganciamento alla punta di materiale del campione che viene estratto all'allontanarsi della punta e dalla diversa composizione del campione in diversi punti. Sfruttando quest'ultimo aspetto si possono utilizzare le curve forza-distanza per ricostruire l'immagine topografica del campione.
L'AFM può essere utilizzato anche per fare della nanolavorazioni (nanolitografia ed anodizzazione).
Viene presentata la risposta al rumore delle levette e di conseguenza le prospettive aperte dalle microlevette (small cantilever). Queste ultime, sono state oggetto di studio anche all'Istituto di Biofisica del CNR di Pisa.
Infine viene data una schematizzazione dell'utilizzo delle levette AFM per lo studio di materiali paramagnetici utilizzando gradienti di campo magnetico.

TESI DISPONIBILI PRESSO IL GRUPPO DI MICROSCOPIA A FORZA ATOMICA DELL’ISTITUTO DI BIOFISICA (IBF/CNR, Area della Ricerca)

Due tesi si collegano a progetti finalizzati allo studio di memorie ottiche su scala nanometrica:

1 - Studio tramite AFM di cristalli bidimensionali di proteine fotosensibili (membrane purpuree di Halobacterium salinarum, contenenti batteriorodopsina). 

2 - Nanopatterning di proteine fluorescenti (GFP, YFP etc…). 

Altre tesi:

3 - Analisi di dati: elaborazione di immagini a risoluzione molecolare di reticoli proteici.

4 - Miglioramento del rapporto segnale/rumore nella microscopia AFM